酪蛋白磷酸肽功能性质的体外研究

Column：Academic Achievement Time：2022-02-14

CPPs的作用效果不仅与N/P值有关，还和它们分子中氨基酸的组成和排序或磷酸基的分布有关。

冯凤琴许时婴王璋

(无锡轻工大学食品学院，无锡,214036)

摘要：以酪蛋白为原料，通过有控制的酶解以及离子交换和凝胶过滤技术制得N/P（摩尔比）不同的酪蛋白磷酸肽（CPPs），并对其体外阻止磷酸钙沉淀的效果进行了分析，测定和比较，在添加量相同时，总的趋势是N/P较小的样品阻止磷酸钙沉淀形成的效果好于N/P值较大的样品。CPPs的作用效果不仅与N/P值有关，还和它们分子中氨基酸的组成和排序或磷酸基的分布有关。

关键词：酪蛋白磷酸肽，N/P值，磷酸钙沉淀

In Vitro Study of the Function Properties of Casein Phosphopeptides(CPPs)

Feng Fengqin Xu Shiying Wang Zhang

(School of Food Science,Wuxi University of Light Industry,Wuxi,214036)

Abstract CPPs with different molar ratio of nitrogen to phosphorus(N/P) were obtained through hydrolyzing casein enzymatically,ion exchange chromatography and gel filtration chromatography.The effects of the various CPPs on ratarding the foemation of calcium phosphate precipitate were determined and compared.The results showed that CPPs with lower N/P were more effective than that with higher one.The amino acid composition and sequence of the peptides(or distribution of phosphoryls)as well as the N/P determine the function effects of CPPs.

Key Word casein phosphopeptides,N/P value,calcium phosphate precipitate

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides,简称CPPs），是由酪蛋白经酶水解、分离、纯化而制得的含有成簇的成簇的磷酸丝氨酰（phosphoseryl）的肽。在动物肠内PH呈中性到弱碱性的环境下，CPPs能阻止磷酸钙沉淀的产生，使溶解钙保持在高水平，从而促进钙的吸收和利用^[1,2]。CPPs的生理活性由其分子中氨基酸的组成和排序（或磷酸基的分布）决定。CPPs的N/P摩尔比可反映CPPs的纯度和磷酸基密度，N/P较低，则纯度或磷酸基密度较高。纯度不同或磷酸基密度不同的CPPs结合钙的能力也不同。本研究通过控制酪蛋白的酶解程度及离子交换色谱和凝胶过滤色谱制得的N/P不同的CPPs，并对其体外结合钙的能力进行分析，测定和比较。

1. 材料与方法

1.1 不同N/P的CPPs样品的制备

向15%的酪蛋白溶液中加入胰酶（苏州吴县西由生物制品厂），于37℃、PH8.0反应至DH（水解度）达8%以上，用HCl调PH至4.5，离心除去沉淀，在上清液中加入氯化钙和乙醇，使其终浓度分别为1%（w/v）和50%，离心所得沉淀经冷冻干燥得样品F，真空干燥沉淀所得样品为A。

在胰酶作用结束后，加入微生物中性蛋白酶（无锡酶制剂厂）继续作用，使第二次酶解的DH达2%以上，用HCl调PH至4.5，离心后弃沉淀，在上清液中加入氯化钙和乙醇，使其终浓度分别为1%（w/v）和50%，离心所得沉淀经冷冻干燥即为样品B。

1.2 样品A和B的纯化

样品A和B中仍然含有一些非磷酸肽（non-phosphopeptides,简称NPPs），NPPs的去除采用离子交换法。采用的离子交换剂为大孔强碱性阴离子交换树脂D290（南开大学化工厂生产），离子交换柱规格为50×5.5（cm）。首先将树脂由Cl型转为Ac型，用冰乙酸将6%的样品A或B的稀溶液的PH调至5.5，以300ml/h的速度将样品上柱。上样后，用去离子水洗去未被吸附的物质，再用0.2NHCl将被吸附的CPPs洗脱下来。洗脱液用NaOH中和后，干燥即得样品A’或B’。

1.3 凝胶过滤色谱

经过离子交换色谱纯化后的样品A’和B’组成仍很复杂，还可根据其性质分成不同的组。用凝胶过滤色谱可将CPPs再按分子量大小进行分组，所采用的凝胶为SephadexG-25，凝胶柱规格为100×2.6（cm），洗脱液为0.01N的HCl。上样前调节样品液的PH至2.0，若有浑浊需过滤除去沉淀，洗脱速度为40ml/h。

1.4 总氮、总磷的测定

总氮用凯氏定氮法测定。总磷的测定参考Morrison的快速微量定磷法^[3]。将干燥至恒重的分析纯KH₂PO₄配成含磷10㎍/ml的标准溶液，分别吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于10ml硬质刻度试管中，用去离子水补加至1.0ml，置于105~110℃烘箱中烘干，加入0.3ml浓H₂SO₄，于电炉上加热至沸，稍冷后加入一滴H₂O₂，继续加热。滴加H₂O₂的过程可重复进行直至试管中溶液无色、澄清为止。继续加热5min，冷却后加水至3ml，加入16.5%的NaSO₃0.1ml，摇匀后，加入1ml12%的钼酸铵溶液，立即摇匀，再加入0.5ml浓度为20㎎/ml抗坏血酸溶液，混匀后，在沸水浴中加热10min，冷却后，用去离子水定容至5.0ml（试管刻度需预先标定），于822nm比色，以含磷量为横坐标，OD822值为纵坐标，绘制标准曲线。样品溶液稀释至含磷1~10㎍/ml，按上法显色，以1.0ml去离子水代替样品液作为空白。

1.5 不同N/P的CPPs阻止磷酸钙沉淀形成的效果比较

CPPs阻止磷酸钙沉淀形成的效果用PH-Atat法检测^[4]。在反应器中加入适量的NaH₂PO₄和CPPs使两者在500ml反应体系中终浓度分别为0.008mol/L和0.0或0.1或0.2g/l。溶液保温至25℃后加入CaCl₂，使之终浓度达0.008mol/L。此时立即用0.1N NaOH将反应体系PH调至7.2并不断滴加0.1N NaOH，使PH保持在7.2。从调节PH即开始计时，PH调至7.2约需2min。从2min开始连续记录0.1N NaOH的消耗量。以时间为横坐标，0.1N NaOH的消耗量为纵坐标作图。

2 结果与讨论

2.1 离子交换色谱

图1为一典型的离子交换色谱图，在前述色谱条件下对CPPs样品进行纯化，得到两个峰，经检测第一个峰不含磷，即为NPPs，第二个峰即为得到了纯化的CPPs。

2.2 凝胶过滤色谱

经离子交换色谱纯化后得到的样品A’和B’再经凝胶过滤都出现两个峰，如图2所示。从样品A’得到样品A’1和A’2，从样品B’得到样品B’1和B’2。分别收集每个峰并测定其总氮和总磷含量。各样品的N/P值见表1.其中明治CPP-Ⅲ为日本明治株式会社会社提供的样品。CPP（g）为广州轻工研究所提供的样品。

表 1 各样品的N/P值

样品	A*	B	A’	B’	A’1	A’2	B’1	B’2	时治CPP-Ⅲ	CPP（g）	F
N/P	6.83	5.82	5.36	4.88	5.17	3.13	4.86	4.51	9.6	7.6	7.47

注：为在真空干燥过程中酪蛋白磷酸肽受热凝结，同时将包含的溶液挤出。为了加快干燥过程曾除去这部分溶液，此溶液中含较高的NPP，因此样品A*的N/P低于用冷冻干燥所得的样品F的N/P。

2.3 不同N/P值的CPPs阻止磷酸钙沉淀形成的效果

在有CaCl₂和Ca（H₂PO₄）₂存在的溶液体系中，Ca₃（PO₄）₂的自发生成涉及下列反应^[4]：

（1）Ca（H₂PO₄）₂→CaHPO₄^-+H⁺

（2）3CaHPO₄→Ca₃（PO₄）₂+HPO₄²^-+2H⁺

两步反应都有H⁺释放出来，所以可用前述PH-Stat法间接检测CPPs对这些反应的影响。为使反应体系的PH保持在一指定值（PH7.2）而加入NaOH的速度（NaOH的加入量随时间而增加）较低时，可认为反应体系中CPPs样品阻止磷酸钙沉淀形成的效果较好。

图3（1-5） CPPs阻止磷酸钙沉淀形成的效果

图3（1）为不添加CPPs和添加不同量的CPPs对磷酸钙沉淀过程的影响。不添加CPPs时，磷酸钙沉淀迅速形成，添加0.1g/l的CPP F几乎可以完全阻止磷酸钙沉淀形成。

图3（2）是对N/P不同的CPPs阻止磷酸钙沉淀形成的效果的比较。CPP A、B、F与对照相比都显著地推迟了磷酸钙沉淀的形成，N/P较小的A和B样品比N/P较大的F样品效果更好。

图3（3）比较了本实验室制备的CPPA、日本明治CPP-Ⅲ和CPP（g）的效果。CPPA阻止沉淀形成的效果最好，其次是CPP（g），相比之下，明治CPP-Ⅲ的效果最差，但即使效果最差的CPP-Ⅲ也使沉淀过程推迟了5~10min。

图3（4）是样品A和B精制前后效果的比较。经离子交换纯化后样品A和B的N/P下降1~1.5.纯化后的样品A’和B’阻止磷酸钙沉淀形成的效果显著增强，A’可使沉淀的大量形成延迟至30~40min，而B’使沉淀的大量形成延迟至更晚，直至40~45min是NaOH消耗量才快速上升。

图3（5）比较了通过凝胶过滤得到的各部分CPPs的效果。A’1和B’1对磷酸钙沉淀形成的推迟作用都很强，两者相比，N/P较小的B’1效果尤其强，而A’2和B’2对推迟磷酸钙沉淀的形成也都有一定作用，A’2使沉淀的形成由对照的5~10min推迟至15~25min，B’2则更迟至20~30min。

由以上分析可知，对CPPs制品而言，添加量相同时，总的趋势是N/P值较小的样品阻止磷酸钙沉淀形成的效果好于N/P值较大的样品。对于从凝胶过滤得到的部分，分子量较大的A’1和B’1之间也有上述趋势。这似乎可以说明，CPPs的效果与CPPs制品内磷酸基的密度有关，磷酸基密度较大，则效果较强。这一实验结果与Sato等^[5]以及Berrocal等^[4]的实验结果是一致的。值得注意的是N/P值较小的A’2和B’2的效果却比N/P值较大的A’1和B’1差得多；A’2和B’2比较，A’2比B’2的N/P值小得多，但A’2的效果却比B’2差。这一结果与Mykkanen等的实验结果有类似之处^[6]。由此推知，CPPs的作用效果不仅和磷酸基的密度有关，还与CPPs的分子结构密切相关。CPPs中氨基酸组成和排序不仅决定磷酸基的密度而且还决定磷酸基在肽链中的分布。CPPs的分子结构与其功能性质的关系还有待实验结果的进一步证实。我们深信这方面的研究工作将为生产结构更为合理的CPPs产品提供理论依据。